Srovnání diagnostických metod giardiózy

V. SVOBODOVÁ, Z. DOLEŽIL* Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno *Krajská hygienická stanice Ostrava

SOUHRN
Svobodová V, Doležil Z. Srovnání diagnostických metod giardiózy. Veterinářství 2001;51:29-30.
Srovnali jsme spolehlivost jednotlivých diagnostických metod giardiózy. Použili jsme flotační metody a sety zajišťující detekci koproantigenů monoklonálními protilátkami s využitím přímé fluorescence nebo ELISA. Citlivost srovnávaných metod byla vysoká.

SUMMARY
Svobodová V, Doležil Z. Comparison of Faust method, direct immunofluorescence, and ELISA for the diagnosis of Giardia infection. Veterinářství 2001;51:29-30.
Faecal samples collected from dogs and cats were tested by the Faust method, used in human patients, and by the direct immunofluorescence technique using the kit Giardia Cell I.F. (Cellabs Diagnostics PTY Ltd.) Different results were obtained in 6.6% of the 60 tested samples. Results of testing of selected positive and negative samples using the kit CELISA of the same manufacturer matched fully those obtained by the above methods.

Giardióza je známé onemocnění lidí, hospodářských a volně žijících zvířat, psů a koček, které je rozšířeno celosvětově1-6 stejně jako u nás.7-10Průjmy způsobené giardiózou mohou oslabovat postižené jedince po několik týdnů i měsíců a během patence se projevují se střídavou intenzitou. Celkové klinické projevy úzce souvisejí s aktivitou imunitního systému pacienta. Infekce se výrazněji projevuje u mláďat a u imunodeficitních jedinců především jako oportunní infekce. Patogenita se může rozdílně projevit nejen u hostitelů stejného živočišného druhu, ale k fázím exacerbace a útlumu dochází i v průběhu života určitého hostitele. Z těchto důvodů je třeba diagnostikovat a eliminovat giardie nejen u pacientů s klinickou giardiózou, ale zamezit i asymptomatickému vylučování cyst. Přestože diagnostika giardiózy využívá různé metody, problémem zůstává vysoký výskyt okultních infekcí. V indikovaných případech napomáhá kombinace vybraných metod.
Sérologické vyšetření není vhodnou diagnostickou metodou, neboť prevalence specifických protilátek proti Giardia intestinalis je v populaci lidí i zvířat vysoká a potvrzuje pouze předchozí kontakt s antigenem a nikoli aktuální hostitelství giardií. Specifické protilátky byly např. nalezeny u 36,5 % psů a 57 % koček.10
Diagnóza giardiózy je založena především na detekci cyst vylučovaných trusem. Cysty jsou drobné nenápadné útvary oválného tvaru velikosti asi 12 µm, které lze pozorovat světelným mikroskopem ve vzorcích trusu zpracovaných některou z flotačních metod. Moderní diagnostické metody umožňují detekci cyst v trusu vazbou monoklonálních protilátek na koproantigeny giardií s využitím přímé imunofluorescence nebo metody ELISA.11,12 Tyto sety jsou součástí nabídky různých firem zabývajících se diagnostickými metodami.
Problémy okultních infekcí unikajících diagnostice, protože se nezdaří detekovat cysty, lze řešit využitím endoskopie. Během endoskopického vyšetření je odebrána duodenální tekutina, kterou je nutno mikroskopicky vyšetřit. V pozitivním případě můžeme pozorovat pohybující se trofozoity velikosti kolem 15 µm, které však musíme udržovat při teplotě 38 °C, jinak brzy ztrácejí schopnost pohybu a odumírají. Obvykle zhotovíme roztěry odebrané duodenální tekutiny a nabarvíme dle Giemsy. Endoskopická diagnostika giardiózy má však pouze omezené využití.13
Naším cílem bylo ověřit a srovnat spolehlivost jednotlivých přímých diagnostických metod giardiózy, které využívají vylučovaných cyst.

Materiál a metodika
Vyšetřili jsme 60 vzorků trusu psů z ostravského útulku metodou dle Fausta využívající k flotaci 33% roztok síranu zinečnatého o specifické hmotnosti 1,18 g/cm3 , kterou se provádí vyšetření stolice lidí.14 Tyto vzorky jsme následně vyšetřili přímou fluorescenční metodou kitem Giardia-Cell I.F. australské firmy Cellabs Diagnostics PTY LTD.
Ze vzorků trusu vyšetřovaných na Ústavu parazitologie FVL v Brně jsme vybrali 8 pozitivních a 2 negativní vzorky trusu psů a 6 pozitivních a 2 negativní vzorky trusu koček. Trus byl vyšetřen flotační metodou s využitím nasyceného roztoku cukru o specifické hmotnosti 1,3 g/cm3 . Fluorescenční test nebyl dle návodu určen k vyšetření trusu koček, proto jsme provedli kontrolní vyšetření 6 pozitivních a 2 negativních vzorků trusu koček.
Metodou ELISA jsme provedli vyšetření na vybraných pozitivních vzorcích trusu 8 psů a 6 koček a negativních 2 psů a 2 koček pomocí setu Giardia CELISA stejné australské firmy.

Výsledky
Vyšetřením vzorků trusu 60 psů z ostravského útulku Faustovou metodou byly cysty zjištěny ve 25 vzorcích (41,6 %), detekcí cyst metodou přímé fluorescence bylo pozitivních 28 vzorků (46,6 %). Diskrepance vznikla u 4 vzorků (6,6 %), 3 vzorky byly pozitivní pouze přímou fluorescencí a 1 pouze metodou dle Fausta. Přímou fluorescencí jsme rovněž potvrdili přítomnost cyst v 6 vzorcích trusu koček a negativní výsledek u dvou kontrolních vzorků.
Vyšetření vzorků trusu metodou ELISA potvrdilo u všech vzorků pozitivní nebo negativní nález získaný flotační metodou.

Diskuse
Problém diagnostiky giardiózy spočívá v intermitujícím vylučování cyst, které je typické pro bičíkovce Giardia intestinalis. U jednotlivých pacientů je nutné vyšetřit 3 vzorky odebírané v průběhu týdne nebo minimálně obden. V některých případech umožní potvrzení suspektní giardiózy až vyšetření 5 vzorků trusu. Přesto lze předpokládat poměrně značný výskyt okultních infekcí. U zvířat chovaných ve větších koncentracích (např. hospodářská zvířata) vyšetříme jednorázově poměrný počet vzorků trusu. Stanovit diagnózu pouze na základě klinických příznaků není možné, neboť střídavé vodnaté průjmy mohou mít zcela rozdílnou etiologii a tudíž i terapii.15-18 Z těchto důvodů je kladen důraz na spolehlivé diagnostické metody.
Citlivost námi srovnávaných metod je vysoká, ale rozdíly spatřujeme v nárocích na vybavení laboratoře, finančních nákladech a potřebě určitých diagnostických zkušeností. Obě flotační metody jsou plně srovnatelné, ve veterinární praxi se uplatňuje především využití nasyceného roztoku cukru. Předpokládají relativně kvalitní mikroskop umožňující minimálně 400násobné zvětšení, pečlivou práci a zkušenosti, neboť falešně pozitivní i negativní výsledky mohou být způsobeny přehlédnutím drobných cyst nebo jejich záměnou. Zvýraznění cyst lze dosáhnout přikápnutím Lugolova roztoku k vyšetřovanému vzorku, který cysty červenohnědě probarví a tak poněkud usnadní jejich rozlišení. V humánní praxi je diagnostika giardiózy prováděna nejen koncentračními metodami, ale zároveň je doplňována speciálním barvením roztěrů stolice. Při použití imerze se tak spolehlivě rozliší patogenní agens, především cysty giardií od cyst patogenních a nepatogenních améb, které se však vyskytují především u lidí, zatímco u zvířat je nacházíme pouze sporadicky.
Diagnostické sety využívající detekci koproantigenů pomocí monoklonálních protilátek nejsou druhově specifické a mohou být využity k diagnostice giardiózy lidí i některých zvířat. Na příbalovém letáčku je obvykle uvedeno použití pro vyšetření vzorků stolice lidí a vzorků trusu hospodářských zvířat a psů. Potvrdili jsme, že monoklonální protilátky reagovaly stejně i na koproantigeny giardií koček a lze tedy využít tyto metody i u koček. Výhodou komerčně vyráběných setů je fakt, že obsahují veškeré potřebné ingredience včetně pozitivních a negativních kontrol a velmi podrobného návodu provedení. Výsledek reakce je jednoznačný vzhledem k nápadné vizualizaci cyst (fluorescence) nebo změně barvy vyšetřovaného vzorku (ELISA). Každý vzorek vždy srovnáváme s pozitivní a negativní kontrolou. Používání setů využívajících přímou fluorescenční reakci bude patrně možné jen ve větších specializovaných laboratořích, protože k vyhodnocení je nutný fluorescenční mikroskop. Kity založené na principu ELISA můžeme vyhodnotit na základě vlastních zrakových schopností, i když exaktního rozlišení např. dubiózních výsledků dosáhneme pomocí ELISA readeru. Diagnostické sety jsou určeny pro širší spektrum hostitelů, protože antigenní variace giardií se výrazně neodlišují. Umožňují tak vyšetřit různé druhy zvířat se suspektní giardiózou a zároveň sledovat epidemiologickou situaci v určitém prostředí, neboť giardie jsou známy mezidruhovým přenosem. Nabídka diagnostických setů je široká, doporučujeme preferovat takový, jenž umožňuje vyšetření jednotlivých vzorků a nejen předem daný počet. Finanční stránka však jistě není zanedbatelná, a proto je na druhé straně levnější provést vyšetření většího počtu vzorků s použitím jedné pozitivní a negativní kontroly, které musíme provádět při každé reakci. Při výběru zvolíme set, který je již ověřený nebo si jeho citlivost srovnáme při prvních vzorcích s jinou metodou.
Parazitózy se zoonotickým potenciálem a oportunní infekce, kam se řadí i giardióza, jsou v současné době závažným celosvětovým problémem v oblasti veterinární i humánní medicíny. Jejich rychlá a spolehlivá diagnostika má zásadní význam z hlediska ochrany zdraví zvířat i člověka.

Práce byla provedená s částečnou podporou grantu FRVŠ MŠMT č. 1242/1999.
Děkujeme RNDr. Evě Nohýnkové, PhD., z odd. tropické medicíny 1. LF UK – FN Bulovka za poskytnutí setu ELISA.

Literatura:
1.Furness BW, Beach MJ, Roberts JM. Giardiasis surveillance-United States, 1992-1997. Mor Mortal Wkly Rep CDC Surveill Summ 2000;49(7):1-13.
2.Fayer R, Trout JM, Graczyk TK, Lewis EJ. Prevalence of cryptosporidium, giardia and eimeria infections in post-weaned and adult cattle on three maryland farms. Vet Parasitol 2000;93(2):103-12.
3.Nizeyi JB, Mwebe R, Nantezy A, Cranfield MR, Kalema GR, Graczyk TK. Cryptosporidium sp and Giardia sp. infections in mountain gorillas (Gorilla gorilla beringei) of the Bwindi Impenetrable National Park, Uganda. J Parasitol 1999;85(6):1084-1088.
4.Measures LN, Olson M. Giardiasis in pinnipeds from eastern Canada. J Wildl Dis 1999;35(4):779-782.
5.Bugg RJ, Robertson ID, Elliot AD, Thompson RC. Gastrointestinal parasites of urban dogs in Perth, Western Australia. Vet J 1999;157(3):295-301.
6.Hill SL, Cheney JM, Taton-Allen GF, Reif JS, Bruns C, Lappin MR. Prevalence of enteritic zoonotic organisms in cats. J Am Vet Assoc 2000;216(5):687-92.
7.Doležil Z, Vaňková D. Některé zkušenosti s giardiózou. České a slovenské parazitologické dny, 22.-26. 5. 2000 Srní, Česká republika, Sborník abstraktů 48–49.
8.Dvořák E, Svobodová V. Giardióza králíků. Veterinářství 1994;44:163,194.
9.Svobodová V, Chroust K. Giardióza a kryptosporidióza v chovech ovcí a koz. Veterinářství 1995;45:406-407.
10.Svobodová V, Svoboda M, Konvalinová J. Srovnání průkazu cyst Giardia intestinalis s výskytem specifických protilátek u psů a koček. Vet. Med. (Czech) 1995;40:141-146.
11.Fedorko DP, Williams EC, Nelson NA, Calhoun LB, Yan SS. Performance of three enzyme immunoassays and two direct fluorescence assays for detection of Giardia lamblia in stool specimens preserved in ECOFIX. J Clin Microbiol 2000;38(7):2781-2783.
12.Maraha B, Buiting AG. Evalution of four enzyme immunoassays for the detection of Giardia lamblia antigen in stool specimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19(6):485-487.
13.Leib MS, Dalton MN, King SE, Zajac AM. Endoscopic aspiration of intestinal contents in dogs and cats: 394 cases. J Vet Intern Med 1999;13(3):191-193.
14.Jírovec O. Koprologická technika (In: Parasitologie pro lékaře), Praha;Avicenum, 1977:131-136.
15.Zajac AM, LaBranche TP, DonogueAR, ChuTengChiao Chu TC. Efficacy of fenbendazol in the treatment of experimental Giardia infection in dogs. Am J Vet Res 1998;59:61-63.
16.Barr SC, Bowman DD, Frongillo MF, Joseph, SL. Efficacy of drug combination of praziquantel, pyrantel pamoat, and febantel against giardiasis in dogs. Am J Vet Res 1998;59:1134-1136.
17.Morgan UM, Reynoldson JA, Thompson RCA. Activities of Several Benzimidazoles and Tubulin Inhibitors against Giardia spp. In Vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1993;37:328-331.
18.Svobodová V, Svoboda M, Lizoň P. Terapie giardiózy psů a koček. Veterinářství 1999;49:336-337.

Adresa autora:
Doc. MVDr. Vlasta Svobodová, CSc.
Ústav parazitologie, FVL VFU Brno
Palackého 1-3
612 42 Brno

Komentáře ke článku 1

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *